Mylène Vaillancourt, M. Sc., chercheuse associée
Peter A. Jorth, Ph. D., chercheur principal
2021
La fibrose kystique (FK) est une maladie héréditaire et potentiellement mortelle caractérisée par des infections sinopulmonaires, des lésions pulmonaires graves, ainsi que des troubles du système gastro-intestinal et d’autres organes. Chez les patients atteints de FK, les mutations du gène CFTR entraînent l’absence ou le dysfonctionnement du canal CFTR à la surface de l’épithélium des voies respiratoires et cela nuit au transport des ions chlorure entre les cellules épithéliales et les voies respiratoires. Ce déséquilibre ionique affecte la teneur en eau de la couche de mucus à la surface des voies respiratoires, entraînant l’accumulation d’un mucus épais propice à la colonisation bactérienne. L’une des espèces bactériennes les plus courantes à l’origine des infections pulmonaires chez les patients atteints de FK est Pseudomonas aeruginosa [1]. Présente chez seulement 10 % des nourrissons atteints de FK, sa prévalence augmente avec l’âge pour atteindre 50 % chez les patients âgés de plus de 25 ans [1], ce qui démontre sa capacité à supplanter d’autres espèces bactériennes et à infecter chroniquement les poumons des FK.
P. aeruginosa possède une remarquable capacité d’adaptation à divers environnements. Grâce à cette polyvalence, cette bactérie se trouve facilement dans des environnements naturels comme le sol et l’eau. Malheureusement, cette caractéristique en fait également un pathogène opportuniste notable à l’origine d’infections nosocomiales aiguës et chroniques graves des poumons (FK, lésions pulmonaires aiguës), de la peau (brûlures) et d’autres organes tels que la vessie et l’intestin. Pour survivre et se répliquer dans ces différents environnements, P. aeruginosa modifie son comportement. Par exemple, elle utilise principalement l’oxygène pour produire son énergie par respiration aérobie, mais peut changer son métabolisme en fermentation si l’environnement est limité en oxygène. Un autre aspect important de la polyvalence de P. aeruginosa est sa grande mutabilité sous la pression sélective de l’évolution qui lui confère de nouvelles capacités avantageuses. Un exemple évident est l’utilisation intensive d’antibiotiques chez les patients atteints de FK, qui sélectionnent les isolats bactériens porteurs de mutations dans les gènes clés impliqués dans la résistance aux antibiotiques.
Notre équipe de chercheurs a étudié en profondeur la variabilité génétique de P. aeruginosa dans les poumons des patients atteints de FK ainsi que les mécanismes qui sous-tendent le développement de la résistance aux antibiotiques chez cette bactérie. Il a spécifiquement étudié les mécanismes impliqués dans la résistance bactérienne à l’aztréonam, le premier antibiotique monobactame approuvé par la U.S. Food and Drug Administration (FDA) pour une utilisation chez les patients atteints de FK [2]. Par la suite, l’équipe a fait évoluer P. aeruginosa in vitro sous exposition continue et cyclique à l’aztréonam afin de refléter les différents protocoles d’administration des antibiotiques chez les patients atteints de FK. Les génomes entiers des isolats résistants à l’aztréonam ont ensuite été séquencés à la recherche de mutations responsables du développement de cette résistance. Cette étude a révélé deux gènes qui ont subi des mutations répétées dans les isolats résistants : nalD et mexR. Ces gènes sont tous deux connus pour participer à la répression de la pompe à efflux MexAB-OprM. Les pompes d’efflux sont des canaux actifs situés à la surface de la membrane cellulaire bactérienne. Les bactéries peuvent utiliser ces pompes d’efflux pour expulser un antibiotique, se protégeant ainsi de l’action de cet antibiotique. Des mutations inactivatrices dans les gènes nalD et mexR déclenchent la surexpression de MexAB-OprM par P. aeruginosa, ce qui les rend résistants à l’aztréonam (Figure 1). Ce résultat est particulièrement important, car, dans la littérature, des mutations dans ces deux gènes ont été trouvées dans 7 à 47 % des isolats de P. aeruginosa provenant de patients atteints de FK.
Au cours de cette même étude, notre groupe a fait plus que trouver les mutations responsables de la résistance à l’aztréonam. Il a fait des observations concernant P. aeruginosa résistant à l’aztréonam qui ont conduit à ses recherches actuelles. Il a d’abord constaté que la sélection de l’aztréonam pouvait entraîner une résistance à plusieurs médicaments. Par exemple, les isolats résistants à l’aztréonam présentaient également une résistance 2 à 5 fois plus élevée à la ciprofloxacine. Il a aussi observé une virulence accrue des mutants nalD et mexR de P. aeruginosa lors d’une infection pulmonaire aiguë chez la souris. Cette hypervirulence chez les P. aeruginosa résistants à l’aztréonam était surprenante, car la résistance aux antibiotiques est généralement associée à une diminution de la virulence et de la capacité d’adaptation. Cette modification du phénotype bactérien est bien connue et a des implications cliniques pour les patients. Par exemple, les isolats virulents de P. aeruginosa peuvent causer des infections aiguës qui déclenchent une réponse inflammatoire exacerbée et provoquent des lésions du tissu pulmonaire et une exacerbation pulmonaire chez les patients. Ces isolats agressifs sont généralement sensibles aux antibiotiques et peuvent être éradiqués après un traitement antimicrobien approprié. Au cours des infections aiguës, un petit sous-ensemble d’isolats de P. aeruginosa peut muter pour acquérir un certain degré de résistance à l’antimicrobien, ce qui peut entraîner des infections pulmonaires chroniques. Ces isolats s’adaptent à l’environnement pulmonaire, perdent leur virulence et développent un phénotype de biofilm. Ce changement phénotypique diminue la réponse inflammatoire et les dommages aux tissus pulmonaires, mais rend ces isolats extrêmement difficiles à éradiquer en raison de leur résistance aux antibiotiques.
Bien que cette dichotomie entre la virulence du P. aeruginosa et sa résistance aux antibiotiques soit bien connue, des travaux antérieurs de notre groupe et d’autres chercheurs suggèrent que les deux phénotypes ne sont pas nécessairement mutuellement exclusifs. Par exemple, une récente étude prospective de 5 ans incluant 510 patients atteints de FK a trouvé une association significative entre le nombre d’exacerbations pulmonaires avec hospitalisation et le développement de la résistance à l’aztréonam chez P. aeruginosa [3]. Cette observation pourrait suggérer la présence d’un isolat de P. aeruginosa qui serait à la fois virulent et résistant à l’aztréonam.
Notre travail actuel vise à déchiffrer les mécanismes par lesquels les mutations évoluées lors de l’exposition à l’aztréonam conduisent à l’hypervirulence chez P. aeruginosa. Plus précisément, nous étudions l’interaction et les effets de ces souches hypervirulentes sur les cellules immunitaires comme les monocytes/macrophages. L’immunité est un facteur essentiel de la clairance bactérienne, non seulement dans la FK, mais dans toute maladie infectieuse; ainsi, une réponse immunitaire altérée de l’hôte peut affecter l’issue d’une infection. Une étude de cas récemment publiée met joliment en évidence l’effet de l’immunité innée sur une population de P. aeruginosa pendant l’infection pulmonaire aiguë d’un patient en soins intensifs [4]. Dans leur rapport, les auteurs ont démontré comment la réponse immunitaire a rapidement diminué les charges de P. aeruginosa pendant l’infection initiale, avant même la première administration d’antibiotiques. Les Pseudomonas restants présentaient une sensibilité accrue aux antibiotiques, ce qui potentialisait l’action d’un traitement antimicrobien supplémentaire et entraînait la suppression de la population bactérienne.
Les monocytes/macrophages constituent l’une des premières réponses immunitaires à une infection bactérienne. Au cours de l’infection précoce, ils « mangent » les bactéries infectieuses dans un processus appelé phagocytose. La phagocytose entraîne la libération par les macrophages de médiateurs antimicrobiens qui tuent les agents pathogènes. Les macrophages jouent également un rôle d’éboueurs en éliminant les cellules mortes et les débris du poumon, ce qui contribue aussi à réduire l’inflammation et à prévenir une réponse immunitaire disproportionnée. Les bactéries peuvent développer plusieurs mécanismes différents pour échapper à la phagocytose et améliorer leur survie dans les poumons FK. Par exemple, P. aeruginosa utilise des biosurfactants glycolipidiques appelés rhamnolipides pour infecter les cellules épithéliales et pour échapper à la phagocytose des cellules immunitaires [5]. Les Pseudomonas virulents peuvent même sécréter des protéases qui dégradent les agents antimicrobiens produits par les macrophages et d’autres cellules immunitaires, et ainsi entraver la clairance bactérienne. Il a été démontré que Pseudomonas LasB, une élastase faisant partie du système de sécrétion de type II, dégrade les composants du complément C3 et du facteur B, deux facteurs critiques dans les processus de reconnaissance des agents pathogènes et des phagocytoses par les macrophages [6]. Les bactéries peuvent également utiliser les molécules produites par les cellules hôtes pour leur propre bénéfice. Par exemple, l’itaconate est un métabolite produit par les macrophages en réponse à une infection bactérienne. Ses propriétés anti-inflammatoires sont essentielles pour rétablir l’homéostasie des tissus et pour prévenir une réponse inflammatoire disproportionnée. L’itaconate possède aussi des propriétés antimicrobiennes en endommageant l’intégrité de la paroi bactérienne et en inhibant la croissance bactérienne. Cependant, il a été démontré que P. aeruginosa évolue sous l’exposition à l’itaconate et devient résistant en modifiant son métabolisme pour utiliser l’itaconate comme source d’énergie et pour former des biofilms [7].
En raison de l’importance des macrophages pendant l’infection, nous étudions comment la mutation nalD chez P. aeruginosa résistant à l’aztréonam peut affecter les interactions avec les macrophages. Nous utilisons un certain nombre d’approches pour étudier comment les P. aeruginosa mutants nalD se développent pendant l’infection des macrophages, modifient leur métabolisme et causent des dommages. Les principales approches que nous utilisons pour répondre à ces questions sont la microscopie à fluorescence et le séquençage de l’ARN de nouvelle génération.
La microscopie à fluorescence est un système basé sur le laser qui permet l’analyse visuelle des interactions bactéries-macrophages à l’échelle moléculaire. Pour réaliser cette technique, les bactéries sont incubées avec des macrophages pendant des périodes déterminées, puis les infections sont conservées chimiquement avant que des molécules spécifiques sur les bactéries et les cellules hôtes soient marquées avec des anticorps fluorescents (figure 2). Ces anticorps fluorescents peuvent ensuite être excités par des lasers fixés au microscope et des détecteurs très sensibles captent la lumière fluorescente émise par les cellules marquées. En marquant avec des anticorps fluorescents de différentes couleurs, nous pouvons quantifier le nombre de macrophages et celui de cellules bactériennes, et déterminer comment ces cellules interagissent physiquement entre elles. En définitive, cela nous aidera à déterminer comment ces bactéries subvertissent les cellules immunitaires essentielles et favorisent la progression de la maladie.
Le séquençage de l’ARN de nouvelle génération est une technique apparentée au séquençage du génome qui permet aux chercheurs de déterminer le profil d’expression génétique complet d’une population de cellules. Au lieu de déterminer le schéma des blocs de nucléotides qui composent le génome, le séquençage de l’ARN est utilisé pour compter le nombre de molécules d’ARNm qui sont produites à partir d’un gène donné lorsque son expression est activée. Cette technique est extrêmement puissante, car elle nous permet de déterminer lesquels des 6000 gènes de P. aeruginosa et des 30 000 gènes humains sont activés pendant l’infection. Cela nous permettra d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour ces infections qui ciblent soit la bactérie, soit l’hôte, en fonction des profils d’expression. Par exemple, si P. aeruginosa exprime des gènes de virulence qui produisent des toxines ou des programmes métaboliques spécifiques, nous pourrons sélectionner des médicaments qui inhibent spécifiquement ces voies. De même, si les macrophages réagissent de manière inappropriée à l’infection, nous pourrons choisir des médicaments qui reprogramment les macrophages pour qu’ils réagissent de manière à favoriser l’élimination de P. aeruginosa.
En raison de la capacité de Pseudomonas à développer une multirésistance aux médicaments et à infecter de manière chronique les patients atteints de FK, il est essentiel de trouver de nouvelles molécules aux propriétés antimicrobiennes structurellement distinctes des antibiotiques actuels. Des chercheurs de l’université de Washington ont récemment commencé à explorer le gallium comme nouvelle thérapie anti-Pseudomonas. Le gallium se distingue des antibiotiques traditionnels, car c’est un métal aux propriétés similaires à celles du fer. Il agit comme un « cheval de Troie » en se liant aux molécules et aux protéines qui fixent normalement le fer. Cependant, comme il réagit différemment du fer, il perturbe le métabolisme du fer des bactéries. Le fer est un nutriment essentiel à la survie et à la croissance des bactéries en agissant comme cofacteur pour un grand nombre de réactions enzymatiques. Ainsi, la substitution du fer par le gallium, un métal, réduit la croissance et la viabilité des bactéries. Un premier essai clinique sur 20 patients a montré des résultats prometteurs pour le traitement au nitrate de gallium administré par voie intraveineuse pendant 5 jours à des patients atteints de FK [8]. Cependant, une étude clinique de phase 2 sur une cohorte plus importante, l’étude IGNITE (NCT02354859), n’a pas montré de changement stable du volume expiratoire forcé chez les patients atteints de FK, bien qu’elle ait légèrement amélioré les symptômes respiratoires et diminué la densité bactérienne dans les cultures de Pseudomonas dans les expectorations. L’une des hypothèses pouvant expliquer ce manque d’efficacité clinique est la faible concentration de gallium mesurée dans les tissus des patients après 5 jours d’administration intraveineuse. Bien que les concentrations de gallium aient augmenté dans le plasma des patients atteints de FK pendant et quelques jours après les traitements, les concentrations détectées étaient relativement faibles et atteignaient à peine la concentration minimale inhibitrice précédemment établie in vitro. Les concentrations détectées étaient encore plus faibles dans les expectorations. Pour résoudre ce problème, l’inhalation de gallium a été proposée comme méthode d’administration plus efficace que l’administration intraveineuse dans un modèle préclinique [9]. Une étude de phase 1/2a randomisée en double aveugle est en cours pour tester la sécurité et la pharmacocinétique du gallium inhalé chez les patients atteints de FK (NCT03669614). En raison de cette promesse, nous sommes intéressés par l’exploration du gallium comme thérapie potentielle pour combattre les infections à P. aeruginosa résistantes aux antibiotiques.
Les travaux de notre groupe et d’autres groupes remettent en question la théorie selon laquelle l’acquisition d’une résistance aux antibiotiques a toujours un impact négatif sur la virulence des bactéries. Dans le cas spécifique de l’aztréonam, certaines mutations trouvées dans les isolats résistants de P. aeruginosa ont conduit à 1) une multirésistance aux médicaments; et 2) une virulence accrue pendant l’infection des macrophages. Les composés antimicrobiens tels que le gallium pourraient constituer un traitement efficace en combinaison avec les antibiotiques classiques pour cibler ces « superbactéries ».
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